|
1. НАЗНАЧЕНИЕ
Неправильное использование антибиотиков в скотоводстве и в производстве кормов может привести к их накоплению в биологических жидкостях и тканях животных. Существуют опасения связанные с потенциальным канцерогенным и генно- токсическим эффектом антибиотиков на организм человека, а также возникновением устойчивой резистентности микроорганизмов к антибиотикам из-за потребления человека пищи, контаминированной этими опасными загрязнителями. Поэтому такие лекарства запрещены для использования в выращивании сельскохозяйственных животных в странах Евросоюза, или же уровень таких лекарств жестко регулируется. Существуют экспресс - тесты предназначенные для выявления опасных контаминантов в продуктах питания. Тест для сырого молока Kalidos (Калидос) имеет высокую чувствительность к широкому спектру антимикробных препаратов, включая антибиотики бета- лактамной, тетрациклиновой и сульфонамидной и др.групп. Принцип его действия основан на ферментации сахара (глюкозы) бактерией bacillus stearothermophilus calidolactis в присутствии индикатора, меняющего свою окраску с фиолетового на желтый. Время, затрачиваемое на анализ – от 2 часов 30 минут до 3 часов.
2. ПРИНЦИП ТЕСТА
Тест Калидос оснащен ампулами, собранными в микропластины, в которых содержится среда агара. Среда агара культивированная спорами bacillus stearothermophilus calidolactis содержит глюкозу и рН- нидикатор бромокрезоловый пурпурный. Тест готов к использованию и не требует предварительной активации и дополнительных реагентов. Для проведения теста нужно всего лишь нанести образец тестируемого молока на поверхность агара и инкубировать тест в течении 2 часов 30 минут до 3 часов в водяной бане, или сухом термостате при температуре 65Со (требуется предварительное термостатирование козьего, овечьего молока). При отсутствии или при незначительном содержании в образце антимикробных субстанций, бактерии начинают развиваться и в процессе роста метаболизируют сахар, превращая его в кислоту. Образовавшаяся кислота меняет цвет индикатора бромокрезолового пурпурного с фиолетового на насыщенный желтый цвет. В присутствии антимикробных субстанций в молоке, развитие спор бактерий ингибируются. В этом случае не произойдет ферментации глюкозы и она не превратиться в кислоту, в результате индикатор среды не поменяет своей первоначальной окраски.
3. КОМПОНЕНТЫ ТЕСТ-НАБОРА
- ампулы, собранные в микропластины, готовые к использованию (4х100); - пипетки объемом 100 мкл -100 шт.;
4. УСЛОВИЯ ХРАНЕНИЯ Хранить при 4-8 Со (хранение при температуре ниже +4Со - недопустимо); Не использовать тесты, в которых изменилась окраска среды в лунках. 5. ДОПОЛНИТЕЛЬНОЕ ОБОРУДОВАНИЕ И МАТЕРИАЛЫ НЕВКЛЮЧЕННЫЕ В НАБОР
- водяная баня с крышкой, с поддержанием температуры 65+- 2С; - термостатический блок (термостат) (код EMK 20AGA, Euroclone) - дозаторы на 100 мкл со стерильными наконечниками.6. ПРОБОПОДГОТОВКА Пробоподготовка молока не требуется. Образцы для исследования: сырое молоко, молоко, подвергнутое тепловой обработке, восстановленное сухое молоко. Сырое молоко должно быть протестировано сразу после доения и сбора. Для анализа может быть использовано козье и овечье молоко.
7. ПОРЯДОК РАБОТЫ
1. Перед проведением анализа доведите температуру исследуемых образцов и ампул теста до комнатной температуры. Нагрейте воду в водной бане до 65Со , достаньте из пакета микропластину о отрежьте от неѐ требуемое количество ампул, снимите с них защитное покрытие из фольги. Оставшиеся ампулы уберите обратно в холодильник. 2. При каждом анализе используйте один или более отрицательных контролей (образцы молока свободные от антибиотиков). 3. При помощи пипетки (дозатора) со стерильными одноразовыми наконечниками, внесите в каждую лунку по 100 мкл образца молока. В целях предотвращения перекрестной контаминации всегда меняйте наконечник дозатора перед забором нового образца. Аккуратно покройте лунки клейкой лентой, или другим гидроизолирующим покрытием. Установите планшет с лунками на водяной бане, или сухом термостате и инкубируйте в течении 2 часов 30 минут до 3 часов при 65С.
Примечание: температура инкубации является важным фактором, влияющим на результат тестирования, поэтому температура водяной бани во время инкубации должна поддерживаться на точно установленном уровне.8. ИНТЕРПРИТАЦИЯ РЕЗУЛЬТАТА После инкубации, извлеките планшет с лунками из инкубатора и охладите его в течение 1-2 мин при комнатной температуре, предварительно удалив клейкую ленту. Слегка постучите лунки об фильтровальную бумагу для удаления капель воды. Оцените изменение первоначальной окраски среды в лунках. - Негативный образец и негативный контроль: образцы без антибиотиков и образец с отрицательным контролем - среда в лунках изменила цвет с фиолетового на желтый. - Позитивный образец: образец с антибиотиком - цвет среды не изменился. Если по истечении 3 часов инкубации, лунки с негативным контролем не изменили исходной окраски на ярко- желтый цвет, проверьте температуру инкубатора и продлите процесс инкубации еще на 15 мин. В течение дополнительного времени инкубации проверяйте окраску лунок каждые 5 мин. Пробы, получившие всевозможные комбинации оттенков фиолетового или желтого, будут относиться к сомнительным результатам и должны быть перепроверены другими методами анализа.. Такое может произойти, в случае, когда в образце содержались антибиотики в количестве, не превышающем порог чувствительности теста. Например, положительный образец можно дополнительно протестировать на наличие пенициллинов. Для этого в данный образец вносят известное количество пенициллина и затем тестируют методом микробиологического анализа. Если пенициллин присутствовал, но позже был ликвидирован пеннициллиназой, в таком случае образец нужно считать отрицательным.9. ПРЕДЕЛ ЧУВСТВИТЕЛЬНОСТИ* В КОРОВЬЕМ МОЛОКЕ (* Предел чувствительности соответствует минимальному количеству антибиотика в пробе, которое способно ингибировать рост бактерий в условиях анализа. )
|
Наименованиеантибиотика
|
Наименьший предел опрделенияЕд/г (мкг/г)
|
|
Амоксицилин
|
0,003
|
|
Ампицилин
|
0,003
|
|
Бацитрацин
|
1,5
|
|
Бензилпеницилин
|
-
|
|
Гентамицин
|
0,025
|
|
Данофлоксацин
|
0,8
|
|
Дапсон
|
-
|
|
Доксициклин
|
-
|
|
Дигидрострептомицин
|
0,2
|
|
Диклоксациллин
|
0,01
|
|
Канамицин
|
0,15
|
|
Клоксацилин
|
0,015
|
|
Линкомицин
|
-
|
|
Марофлоксацин
|
0,8
|
|
Мономицин
|
-
|
|
Нафциллин
|
0,005
|
|
Неомицин
|
0,05
|
|
Оксацилилин
|
0,01
|
|
Окситетрациклин
|
0,1
|
|
Олеандомицин
|
-
|
|
ПеницилинG
|
0,002
|
|
Пиперацилин
|
-
|
|
Рифамицин
|
-
|
|
Рифампицин
|
0,1
|
|
Спирамицин
|
0,6
|
|
Спектиномици
|
0,2
|
|
Стрептомицин
|
0,4
|
|
Сульфадиазин
|
0,025
|
|
Сульфадиметоксин
|
0,025
|
|
Сульфакиноксалин
|
0,025
|
|
Сульфамеразин
|
0,025
|
|
Сульфаметазин
|
0,1
|
|
Сульфаметоксазол
|
0,025
|
|
Сульфаметоксипиридазин
|
-
|
|
Сульфатиазол
|
-
|
|
Тетрациклин
|
0,1
|
|
Тилозин
|
0,04
|
|
Триметоприн
|
0,1
|
|
Хорамфеникол(левомицитин)
|
2,5
|
|
Хлортетрациклин
|
0,1
|
|
Цефазолин
|
-
|
|
Цефалексин
|
-
|
|
Цефалониум
|
-
|
|
Цефаперин
|
-
|
|
Цефацетрил
|
-
|
|
Цефкином
|
-
|
|
Цефтиофур
|
-
|
|
Цефуроксим
|
-
|
|
Эритромицин
|
0,1
|
|
